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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告可以反映聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果，那么聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告是什么呢？

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是利用DNA片段旁側(cè)兩個短的單鏈引物，在體外快速擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。它應(yīng)用熱穩(wěn)定的聚合酶，通過雙鏈DNA模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復(fù)循環(huán)，DNA片段以指數(shù)方式增加了百萬倍。從非常微量的DNA甚至單個細(xì)胞所含有的DNA起始，可產(chǎn)生ug量的PCR產(chǎn)物。

由于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法高度靈敏，少量的靶分子即可擴(kuò)增至無限數(shù)。因此要防止聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物污染環(huán)境而引起以后的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)假陽性。為此，應(yīng)將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物檢測等過程與標(biāo)本制備及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)管的制備盡量在空間分開，最好在不同的房間進(jìn)行。通常可將實(shí)驗(yàn)空間分為標(biāo)本處理區(qū)、反應(yīng)混合制備和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)等。

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在生活中也用的到，具體聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用如何呢？

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是目前的一種最基本也是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，由于PCR反應(yīng)的快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)使其在短短的數(shù)年時(shí)間即被廣泛應(yīng)用于各大領(lǐng)域，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)業(yè)中的運(yùn)用都相對廣泛。

在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)開始的頭一次循環(huán)時(shí)，反應(yīng)從遠(yuǎn)低于Tm值的溫度開溫，由于Taq酶在低溫時(shí)仍具有活性，這時(shí)就可能因引物與模板非特異性配對面出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物或出現(xiàn)引物二聚體然后在以后整個聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)中，非特異性產(chǎn)物反復(fù)擴(kuò)增，而使聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)嚴(yán)重失敗。為了盡量消除這種非特異性擴(kuò)增，可以使用熱起動的方式，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)中加入抗Taq酶抗體。抗體與Taq酶結(jié)合，使Taq酶活性受抑制。

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)純度要求不高，那么聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)原理是什么呢？

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR是一種體外DNA 擴(kuò)增技術(shù)，是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3，末端有引物存在的情況下，用酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸，多次反復(fù)的循環(huán)能使微量的模板DNA得到極大程度的擴(kuò)增，從而在短時(shí)間內(nèi)使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加。

通常PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)名詞解釋

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在某些領(lǐng)域很有用處，那么聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)名詞解釋是什么呢？

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)時(shí)加入的DNA模板量一般為100-100000拷貝，現(xiàn)在的技術(shù)水平已能從單個細(xì)胞制備出相應(yīng)的cDNA文庫。DNA模板含量合適，可以減少聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多次循環(huán)帶來的堿基錯配。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)中純化的Taq酶在體外無3-5外切酶活性，在擴(kuò)增過程可引起錯配。錯配堿基的數(shù)量受溫度、Mg2+濃度和循環(huán)次數(shù)的影響。通常，30次循環(huán)Taq酶的錯配率約為0.25％，高于Klenow酶的錯配率。Taq酶在每一次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000。應(yīng)用低濃度的dNTP(各20μmol/L)、1.5mmol/L的Mg2+濃度、高于55℃的復(fù)性溫度，可提高Taq酶的忠實(shí)性，此時(shí)的平均錯配率僅為5x10^-6次/(核苷酸*循環(huán))。

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