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rna聚合酶鏈式反應

rna聚合酶鏈式反應是什么

rna聚合酶鏈式反應技術(shù)

rna聚合酶鏈式反應的原理

rna聚合酶鏈式反應操作過程

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rna聚合酶鏈式反應是什么

rna聚合酶鏈式反應主要檢查的是RNA，那么rna聚合酶鏈式反應是什么來的呢？

RNA的聚合酶鏈式反應：目前常用的RNA檢測方法有原位雜交，點雜交，Northern印記雜交以及核酸酶保護試驗等。這些方法的普遍缺點是難以檢測低豐度的信使RNA，并且操作繁瑣，將RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR結(jié)合起來建立RNA聚合酶鏈式反應（RT-PCR）則可以克服上述缺點。

其實人體一個細胞含RNA約10pg（含DNA約7pg）。與DNA相比，RNA種類繁多，分子量較小，含量變化大。RNA可根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同分為信使RNA和非編碼RNA。非編碼RNA分為非編碼大RNA和非編碼小RNA。非編碼大RNA包括核糖體RNA、長鏈非編碼RNA。非編碼小RNA包括轉(zhuǎn)移RNA、核酶、小分子RNA等。小分子RNA（20~300nt）包括 miRNA、 SiRNA、 piRNA、scRNA、 snRNA、 snoRNA等，細菌也有小分子RNA（50~500nt）。

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rna聚合酶鏈式反應技術(shù)

RNA方面有rna聚合酶鏈式反應技術(shù)，那么rna聚合酶鏈式反應技術(shù)什么樣呢？

rna聚合酶鏈式反應技術(shù)先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下以信使RNA為模板合成cDNA，再以CDNA為模板進行PCR反應。此法快速，簡便，并且靈敏度高。rna聚合酶鏈式反應技術(shù)可以檢測單個細胞中少于10個拷貝的特異RNA。

任何生物大分子都有結(jié)構(gòu)的多樣性和特異性。RNA的結(jié)構(gòu)特異性主要體現(xiàn)在組成RNA的單體——核糖核苷酸的數(shù)目和排列順序上。比如某段RNA含有100個核糖核苷酸，它的多樣性可以達到4的100次方；但每一種RNA只有一種結(jié)構(gòu)，這就是它的特異性。就像班里有50個學生，排位時第一個學生有50中選擇，第二個學生有49個選擇，以此類推，班里排位的方式可以多達50的階乘，這就是多樣性；但現(xiàn)實中班里的位次就是眼前這一種，這就體現(xiàn)了特異性。

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rna聚合酶鏈式反應的原理

RNA跟DNA的機制是不太一樣的，其中rna聚合酶鏈式反應的原理是什么呢？

rna聚合酶鏈式反應的關(guān)鍵步驟是RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模板必須是完整。并且不含DNA，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。若RNA模板中污染了微量DNA，擴增后會出現(xiàn)特異DNA的PCR產(chǎn)物。而cDNA擴增產(chǎn)物卻很少，必要時可用無ＲＮａｓｅ的ＤＮａｓｅ處理反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，消除ＤＮＡ后在進行ＰＣＲ。如果蛋白質(zhì)未除盡可與ＲＮＡ結(jié)合，從而影響反轉(zhuǎn)錄和ＰＣＲ反應。

目前轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）在蛋白質(zhì)合成過程中負責轉(zhuǎn)運氨基酸、解讀mRNA遺傳密碼。tRNA占細胞總RNA的10%~15%，絕大多數(shù)位于細胞質(zhì)中。tRNA由Crick于1955年提出其存在，Zamecnik和 Hoagland于1957年鑒定。

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rna聚合酶鏈式反應操作過程

rna聚合酶鏈式反應操作得當才準確，那么rna聚合酶鏈式反應操作過程是什么呢？

rna聚合酶鏈式反應定量方法包括PCR反應和轉(zhuǎn)錄反應二個步驟，二個步驟相互接續(xù)，可以只用一個試管來完成，先用PCR來擴增目標基因，但PCR循環(huán)數(shù)比通常少5-10個循環(huán)，雖然此時反應液中擴增產(chǎn)物的總量較少，不能直接用通常的核酸染色劑來定量測定，但因為PCR反應仍處在直線階段未進入平坡期，所以擴增產(chǎn)物總量與樣品中原始模板的數(shù)量成正比例。其在于用轉(zhuǎn)錄反應使PCR擴增產(chǎn)物進一步按線性增加的方式合成RNA。這一設想能付之實現(xiàn)的基礎是發(fā)現(xiàn)PCR反應液的必要成份脫氧核糖核苷酸，正，反引物和DNA聚合酶等在相當寬的濃度范圍內(nèi)對轉(zhuǎn)錄反應沒有可測見的顯著影響。

所以，在完成PCR反應后可以不經(jīng)過任何分離步驟而進入轉(zhuǎn)錄反應。在RNA聚合酶和核糖核苷酸底物過量，反應溫度和時間固定的條件下，RNA的合成量與轉(zhuǎn)錄反應的模板數(shù)量，即PCR擴增產(chǎn)物的數(shù)量成正比例，所以，最終合成的RNA量反映了樣品中原始模板DNA的數(shù)量。由轉(zhuǎn)錄反應合成的RNA量可達到模板數(shù)量的幾百至千倍，從而可以方便地用溴乙錠或其他核酸染色劑定量測定。

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