聚合酶鏈式反應已經相對成熟了,那么聚合酶鏈式反應的原理及功能是什么呢?
聚合酶鏈式反應是在試管中進行DNA復制反應,基本原理與體內相似,不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶,用合成的DNA引物替代RNA引物,用加熱(變性)、冷卻(退火、保溫(延伸)等改變溫度的辦法使DNA得以復制,反復進行變性、退火、延伸循環(huán),就可使DNA無限擴增。
聚合酶鏈式反應能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段,并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此,聚合酶鏈式反應技術一經問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學的各個領域。通常需要檢查的人群為疑似某種特定的疾病病人,進行分子特異性檢查。
聚合酶鏈式反應一般要在實驗室進行,那么聚合酶鏈式反應的原理和過程什么呢?
聚合酶鏈式反應就是將聚合酶鏈式反應反應體系升溫至95℃左右,雙鏈的DNA模板就解開成兩條單鏈,此過程為變性。然后將溫度降至引物的Km值以下,3端與5端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補區(qū)域結合,此過程稱為退火。當將反應體系的溫度升至70℃左右時,耐熱的Taq DNA聚合酶催化四種脫氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互補方式依次加至引物的3端,形成新生的DNA鏈。每一次循環(huán)使反應體系中的DNA分子數增加約一倍。
聚合酶鏈式反應理論上循環(huán)幾次,就增加為2^n倍。當經30次循環(huán)后,DNA產量達2^30拷貝,約為10^9個拷貝。聚合酶鏈式反應擴增過程見圖8-1。由于實際上擴增效率達不到2倍,因而應為(1+R)^n,R為擴增效率。
聚合酶鏈式反應這項技術已經相對完善,那么聚合酶鏈式反應的原理及技術怎么樣呢?
聚合酶鏈式反應的原理就是DNA的半保留復制。聚合酶鏈式反應反應中變性這一步很重要,若不能使模板DNA和聚合酶鏈式反應產物完全變性,聚合酶鏈式反應反應就不能成功,DNA分子中G+C含量愈多,要求的變性溫度愈高。太高的變性溫度和時間又會影響Taq酶的活性,通常的變性溫度和時間分別為95℃、30s,有時用97℃、15s。
雖然DNA鏈在變性溫度時兩鏈分離只需幾秒鐘,但反應管內部達到所需溫度還需要一定的時間,團此要適當延長時間。為了保證模板DNA能徹底變性.最好為7-10min,然后在以后的循環(huán)中,將變性步驟設為95℃/min。
聚合酶鏈式反應靈敏度是比較高的,那么聚合酶鏈式反應的原理是什么呢?
聚合酶鏈式反應的原理是雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現對于PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環(huán)加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,并逐步應用于臨床。
聚合酶鏈式反應的延伸溫度一般為72℃左右,此時Taq酶活性為每秒鐘摻入核苷酸35-100個,2kb的片段用1min已足夠,若DNA片段較長,擴增時間可適當延長。聚合酶鏈式反應延伸時間過長又可引起非特異性擴增。
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