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反轉錄聚合酶鏈式反應

反轉錄聚合酶鏈式反應技術

反轉錄聚合酶鏈式反應的局限性

反轉錄聚合酶鏈式反應是什么

反轉錄聚合酶鏈式反應操作過程

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反轉錄聚合酶鏈式反應技術

反轉錄聚合酶鏈式反應技術比較先進，那么反轉錄聚合酶鏈式反應技術是什么呢？

反轉錄聚合酶鏈式反應技術從嗜熱棲熱菌ＨＢ８中分離得到Ｔｔｈ耐熱ＤＮＡ聚合酶，此酶還具有反轉錄酶活性，９５攝氏度時該酶的半衰期為２０分鐘具有５—３外切酶活性，無３—５外切酶活性，利用Ｔｔｈ耐熱ＤＮＡ聚合酶同時具有反轉錄酶的特點，可以簡化ＲＴ－ＰＣＲ，并且比Ｔａｑ聚合酶反應敏感度高１００倍。所以更優越。Ｔｔｈ聚合酶作用溫度高，可消除ＲＮＡ的二級結構對反轉錄反應的影響，增加ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的反轉錄的活性，可增加ＲＴ－ＰＣＲ反應靈敏性。

反轉錄過程由反轉錄酶催化，該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補DNA（cDNA）。反轉錄酶存在于一些RNA病毒中，可能與病毒的惡性轉化有關。人類免疫缺陷病毒（HIV）也是一種RNA病毒，含有反轉錄酶。在小鼠及人的正常細胞和胚胎細胞中也有反轉錄酶，推測可能與細胞分化和胚胎發育有關。

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反轉錄聚合酶鏈式反應的局限性

有些條件下不適合做反轉錄聚合酶鏈式反應，那么反轉錄聚合酶鏈式反應的局限性是什么呢？

反轉錄聚合酶鏈式反應需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。大多數有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反轉錄聚合酶鏈式反應得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。

而利用反轉錄聚合酶鏈式反應可對未知序列擴增后進行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆，建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉位因子和已知序列DNA旁側病毒整合位點分析等研究。

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反轉錄聚合酶鏈式反應是什么

反轉錄聚合酶鏈式反應是聚合酶鏈式反應的一種，具體反轉錄聚合酶鏈式反應是什么呢？

反轉錄聚合酶鏈式反應是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段。實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究。

反轉錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)為引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA，它與RNA模板形成RNADNA雜交體。隨后又在反轉錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導的DNA合成過程。

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反轉錄聚合酶鏈式反應操作過程

反轉錄聚合酶鏈式反應操作有一定講究，那么反轉錄聚合酶鏈式反應操作過程什么樣呢？

反轉錄聚合酶鏈式反應用T4連接酶在稀DNA濃度下環化更容易形成單環。在一些實驗中，為產生對反轉錄聚合酶鏈式反應大小適當的DNA片段需要兩種內切酶，但這樣所產生的片段末端則不適于連接，環化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內切酶失活。

反轉錄聚合酶鏈式反應用傳統的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3-4kb。在許多情況下，首先需要進行Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適于環化及反向PCR的片段的末端段。能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游或上游區，而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增，并帶有由內切酶和環化類型決定的接點(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。

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